基因治疗（gene therapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。能实现治疗蛋白的长期表达和组织特异性表达，无需药物干预、放疗或手术治疗，即可从根源上解决传统疗法存在的一系列问题。其中包括转基因等方面的技术应用，也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。
基因病毒载体有慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体（AAV，Adeno-associated virus）、逆转录病毒载体、杆状病毒载体等。腺相关病毒载体应用较广。截止2019年9月，在ClinicalTrails.gov上注册了190项以AAV为载体的基因治疗临床试验，截止2021年7月，已经增加至256个。这一现象可能是AAV载体介导的血友病基因治疗临床试验取得良好结果的结果1。目前，三款以重组AAV为载体的基因治疗药物已获批上市。其中Glybera于2012年在欧盟上市，使用的血清型是AAV1,由于其高昂的治疗费用，目前已经退市。另外两个在美国上市的AAV治疗产品分别以AAV2和AAV9为载体，治疗眼部疾病和肌肉萎缩症。腺相关病毒属于微小病毒科依赖病毒属，是目前已知的一类结构最简单的无包膜单链DNA缺陷型病毒。直径约25nm, 由蛋白衣壳和长度为4.7kb的单链DNA基因组构成，基因组两端为两个T型的末端反向重复序列（ITR），是病毒DNA复制的起点和触发包装的信号，基因组的REP基因与AAV复制有关，目前所使用的AAV载体均删除REP基因，使基因组整合的可能性大大降低。已发现12种AAV血清型和100多种AAV突变体，不同血清型对组织和器官的亲和性不同。而且AAV具有安全性高、免疫原性低、病毒滴度高等优点，是安全级别最高RG1级的基因治疗载体，被认为是“最有前景的基因治疗载体”。
图一 AAV载体结构
腺相关病毒被宿主细胞表面的糖基化受体识别，通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞，在内吞形成的内涵体酸化之后，病毒衣壳构象发生变化，使得病毒可从内涵体脱离，并通过核孔进入细胞核，或经过泛素化途径被降解。进入细胞核的AAV颗粒释放搭载的目标基因，目标基因在核内酶的作用下形成完整双链，转录、翻译成蛋白产物2-3。AAV进入细胞核之后，绝大多数情况会以游离的环状DNA形式存在，能在宿主细胞中稳定并持续表达。作用机制如下如图二。
图二 AAV载体递送机制
生物分布反映了药物进入人体后向各组织器官转运、代谢及蓄积的情况。根据药物的载体类型、给药途径、治疗疾病类型等因素选择检测样本，通常用于生物分布研究的组织器官样本包括: 血液、注射部位、皮肤、生殖腺、大脑、胆囊、肝脏、肾脏、肺脏、心脏和脾脏，淋巴结、骨髓、眼球、视神经、坐骨神经、脊髓、脑脊液等。取样时间点至少包括在靶组织和非靶组织的峰值和稳态阶段。根据基因治疗药物的特征，通常采用实时定量聚合酶扩增检测进行分析。组织样本经过适当处理以后，提取样本基因组DNA，通过测定其中药物基因的拷贝数来评估。脱落是指基因治疗产品通过排泄物（粪便）、分泌物（尿液、207 唾液、汗液、鼻咽液等）或皮肤（脓疮、伤口等）排出体外。脱落分析应包括对其排出体外成分感染能力的检测。定量聚合酶扩增检测和传染性试验是两种常用的检测脱落病毒载体的方法。传染性试验的优点是只检测完整的和有可能被传播的病毒和载体，但是灵敏度较差。基因治疗产品可能导致的全身系统性细胞因子升高、多器官炎症反应。产生针对载体和转基因产物的抗体、激活细胞毒性T淋巴细胞、T淋巴细胞分泌针对特异性转基因产品的细胞因子。可使用Bio-Plex 悬液芯片多重检测平台，电化学发光反应器，酶标仪等进行单因子或多因子检测。各平台细胞因子检测参数对比如图三。
图三 各平台细胞因子参数对比
T淋巴细胞分泌针对特异性转基因产品的细胞因子可通过酶联免疫斑点检测(Enzyme-linked immune absorbent spot, ELISPOT) 来完成。ELISPOT通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个活性细胞，从而计算出分泌该蛋白或者细胞因子的细胞的频率。主要试验步骤分为细胞培养、抗原刺激细胞分泌细胞因子、被板底抗体捕获的细胞因子与加入生物素二抗结合、酶标亲和素与生物素反应显色。
图四 ELISPOT 反应原理
免疫原性主要考虑3个方面，载体的免疫原性评估，核酸的免疫原性评估及蛋白表达产物的免疫原性评估。
定制计生物素标记和地高辛标记的载体/核酸/蛋白，并和预包被链霉亲和素的96孔板形成固相化结构，加入荧光素标记的抗地高辛的抗体获得检测信号值。实验过程操作简便，易操作。定制生物素和钌标记的载体/核酸/蛋白，使用桥连方法检测ADA也是常用方法。在人类基因治疗试验中，需要对基因治疗产品的抗药抗体和中和抗体进行检测，以评估药物对安全性和药效的影响。同时，为了排除预存抗体的影响，临床试验常常采取的一个策略是排除具有抗腺相关病毒载体的中和抗体阳性的个体，这也需要在受试人入组前进行中和抗体的检测。目前已发展出多种检测抗AAV抗体的方法4-5。基于ELISA的方法易于建立，并能相对灵敏地测量出与AAV结合的抗体，但是这并不一定反映它们的中和活性。此外，在AAV基因转移试验之前，体内试验也被用来对受试者进行预筛选6-8。然而，这些方法很难标准化和验证，而且它们比体外方法更耗时和昂贵。基于细胞的体外检测被广泛用于抗AAV中和抗体的样本筛选9-12。抗AAV中和抗体试验的主要设计原理如下:首先构建一个和基因药物有相同衣壳蛋白的腺相关病毒，AAV-GFP,该病毒能自主表达绿色荧光蛋白。使用AAV-GFP感染细胞，通过检测荧光信号来评判感染的效果。在AAV-GFP感染细胞之前，将其与样本血清进行预先孵育，样本血清中的抗AAV中和抗体能够阻断AAV-GFP感染细胞，导致荧光信号的衰减，从而评价血清中抗AAV中和抗体的效果。该方法可用于中和抗体的预筛及给药后的中和抗体的检测。
图五 中和抗体检测流程
以AAV为载体的基因治疗产品研发布局代表公司包括Spark、uniqure、biomarin、sangmo等，这些公司均有多个在研基因治疗药物。FDA曾在多个场合表示，他们预计，到2025年，每年将有10至20种细胞和基因疗法获批。中国在研基因治疗药物适应症都集中于单基因遗传病和肿瘤。基因治疗“一次性给药”的特性对病人吸引力越来越大。预计2024年全球基因治疗行业发展趋势，基因治疗药物将会逐步向血液病、眼部疾病、中枢神经系统疾病等其他适应症发展。
随着生物分析领域对于AAV载体药物研究经验的不断积累，以及新的分析技术的涌现，将为AAV载体药物的免疫原性及中和活性研究提供更广阔的思路，和更精准高效的分析检测。这也将推动全球精准医疗事业的蓬勃发展，助力早日实现健康中国梦。1.Nathwani AC, Reiss UM, Tuddenham EG, et al. Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B. N Engl J Med 2014;371:1994–2004.2.Wang D, Tai P W L, Gao G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery [J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2019: 1.3.Deverman B E, Ravina B M, Bankiewicz K S, et al. Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2018, 17(9): 641.4.Gray S J, Kalburgi S N, McCown T J, et al. Global CNS gene delivery and evasion of anti-AAV-neutralizing antibodies by intrathecal AAV administration in non-human primates[J]. Gene therapy, 2013, 20(4): 4505.Masat E, Pavani G, Mingozzi F. Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions. Discov Med 2013;15:379–389.6.Nathwani AC, Reiss UM, Tuddenham EG, et al. Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B. N Engl J Med 2014;371:1994–2004.7.Nathwani AC, Tuddenham EG, Rangarajan S, et al. Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. N Engl J Med 2011;365:2357–23658.Wang L, Calcedo R, Wang H, et al. The pleiotropic effects of natural AAV infections on liver-directed gene transfer in macaques. Mol Ther 2010;18:126–134.9.Calcedo R, Morizono H, Wang L, et al. Adeno-associated virus antibody profiles in newborns, children, and adolescents. Clin Vaccine Immunol 2011;18:1586–1588.10.Boutin S, Monteilhet V, Veron P, et al. Prevalence of serum IgG and neutralizing factors against adeno-associated virus (AAV) types 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the healthy population: implications for gene therapy using aav vectors. Hum Gene Ther 2010;21:704–71211.Mingozzi F, Chen Y, Edmonson SC, et al. Prevalence and pharmacological modulation of humoral immunity to AAV vectors in gene transfer to synovial tissue. Gene Ther 2013;20:417–424.12.Halbert CL, Miller AD, Mcnamara S, et al. Prevalence ofneutralizing antibodies against adeno-associated virus (AAV) types 2, 5, and 6 in cystic fibrosis and normal populations: implications for gene therapy using AAV vectors. Hum Gene Ther 2006;17:440–447.
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